測序常見問題及其分析

　1、PCR產物測序時出現重疊峰

　　問題圖1（模板中有堿基缺失，往往是單一位點（1-1）或兩個位點（1-2）堿基缺失導致測序結果移碼）

　　圖1-1

　　圖1-2

　　解決方法：將PCR產物克隆到質粒（如T載體）中挑單克隆測序，或將PCR產物進行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進行測序。

　　問題圖2（PCR產物不純，含部分序列一致的兩種以上的片段，長度不一）

　　圖2

　　解決方法：主要原因是PCR產物沒有純化，含有部分序列一致的兩種以上長度不一的片段，將PCR產物進行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進行測序，便可解決。

　　問題圖3（測序引物有堿基缺失）

　　測序引物有堿基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的堿基缺失即圖1有些類似，所不同的是模板堿基缺失一般是在一段正常測序序列后才出現移碼，而引物堿基缺失的話，則從測序一開始就出現移碼，表面在圖形上便是一開始就是嚴重的峰形重疊。

　　解決方法：重新合成引物，或將引物進行PAGE純化

　　2、克隆測序時出現峰形重疊

　　原因：所挑選的重組子不是單克隆，所提供的測序用質粒中含有兩種以上插入片段不同的質粒；或是是送測序的菌液污染

　　解決方法：重新挑單克隆的菌落（劃線分離單菌落），提質粒或送菌液再次測序。

　　3、樣品有雜合/突變位點

　　模板中有雜合型突變，也就說模板本身在這個位點出現突變；或者是從基因組中擴增出來的雜合位點。如果模板有雜合（突變或缺失），那么測序圖形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重疊峰（如圖中箭頭所示）。

　　解決方法：建議將DNA片段克隆到載體再測序。

　　4、polyA/T和C/Gcluster導致的套峰和測序信號衰減

　　圖4-1

　　圖4-3

　　圖4-4

　　RACE測序時經常遇到圖4-1和圖4-4的情形，解決方法：從另一端測序；但如果這樣的序列出現在中間，呵呵，目前還沒有很好的解決方法，要看測序公司的本事了。

　　C/Gcluster在PrV基因組測序時遇到過。后來還是讓TaKaRa公司給解決了，雖然不喜歡鬼子，但有時候卻不得不用它們的產品和服務。

　　5、基因中含有重復序列

　　可能的原因:樣品中含有重復序列導致的測序結果和PolyA/T的結果一樣，會導致Frame滑動，較短的重復序列會導致測序結果出現移碼；而較長的重復序列會使定序信號衰減。

　　解決辦法:反向測序有時能夠順利的通過重復序列區域（但不是一定都能夠），通過多次的測序結果比對，拼接可以得到全序列結果。